INFORMAZIONI GENERALI

La Border Disease (BD), conosciuta anche come hairy shaker disease, è una malattia virale causata da un virus appartenente alla famiglia Flaviviridae, genere Pestivirus (BDV). Il BDV è simile al virus della Diarrea Virale Bovina (BVDV) e al virus della Peste suina classica (PSC). Esso è in grado di infettare un'ampia gamma di ungulati, sia domestici che selvatici, ma in generale gli ovini/caprini sembrano naturalmente sensibili all'infezione. Diversi studi hanno riportato la plasticità adattativa del BDV nell'attraversare la barriera di specie e infettare suini e bovini, in particolar modo quelli che vivono a stretto contatto con ovi-caprini. Inoltre, il BDV può essere trasmesso da specie domestiche a specie selvatiche, come camosci, lama, alpaca, bisonti e renne. La Border Disease non è una zoonosi.

La Border Disease è una patologia congenita degli agnelli e causa episodi di disordini riproduttivi nelle pecore adulte, riportata a livello globale. Gli agnelli possono mostrare anche sintomi neurologici, che in alcuni casi possono coinvolgere anche la paralisi delle zampe posteriori. Oltretutto, BD passa spesso inosservata, in quanto i suoi sintomi, legati soprattutto alla fertilità, piuttosto che alla morbilità o alla mortalità degli animali, non vengono attribuiti direttamente all'infezione da BDV ma confusi con quelli provocati da altri agenti patogeni, come BVDV, Chlamydophila spp., Campylobacter spp., Salmonella spp., E. coli e Corynebacterium spp. Oltre ai segni clinici direttamente causati dal virus, la presenza dell’infezione da BDV provoca anche un aumento del rischio di altre infezioni. Infine, la malattia influisce sulla riproduzione, riduce il tasso di crescita e quindi ritarda la macellazione in condizioni commerciali, con perdite economiche sostanziali per l'industria zootecnica.

AGENTE EZIOLOGICO

BDV (Pestivirus D) è un virus a RNA a singolo filamento, dotato di envelope, simile al virus della peste suina classica (Pestivirus C) e al virus della diarrea virale bovina (BVDV) di tipo 1 (BVDV1) (Pestivirus A), il BVDV di tipo 2 (Pestivirus B) e i virus Hobi-like (Pestivirus H). In base agli effetti su colture di tessuti sensibili, simili a quelli del BVDV, anche per BDV si possono distinguere due biotipi: il citopatogeno, che causa vacuolizzazione e lisi delle cellule infette, e il non citopatogeno, che non provoca segni di infezione microscopicamente visibili. Quasi tutti gli isolati di BDV non sono citopatogeni in coltura cellulare, sebbene occasionalmente siano stati isolati stipiti citopatogeni. La comparsa di ceppi citopatogeni negli animali persistentemente infetti (PI) è fondamentale per l’induzione della malattia delle mucose che, tuttavia, si verifica raramente negli ovini.

DISTRIBUZIONE DELLA MALATTIA

Il primo caso di infezione da BDV è stato segnalato nelle pecore nel 1959 nelle regioni di confine dell'Inghilterra e del Galles. Anche se i pastori di quel territorio vedevano già da molti anni agnelli deboli, con il vello ruvido, e tremanti, nel 1959 fu descritta per la prima volta una tale condizione clinico-patologica, che fu denominata “malattia di confine” o "Border Disease".

L'infezione da BDV negli animali domestici e selvatici, soprattutto negli ovini, è stata confermata in tutto il mondo. Indagini sierologiche e, in alcuni casi, anche l'isolamento del virus in alcuni ungulati hanno dimostrato l'infezione in più di 50 specie diverse, in America (Stati Uniti e Messico), Africa (Turchia), Asia (Cina, India, Giappone), Nuova Zelanda, Australia ed Europa (Austria, Francia, Germania, Italia, Paesi Bassi, Slovacchia, Spagna, Svizzera e Regno Unito).

È probabile che il BDV sia presente in altri Paesi europei ed extraeuropei in cui le dimensioni e la densità della popolazione di piccoli ruminanti sono sufficienti a consentire la circolazione della malattia. D'altra parte, i proprietari di greggi di piccoli ruminanti sono generalmente inconsapevoli della malattia, soprattutto perché i sintomi clinici non sono molto evidenti e spesso non vengono riconosciuti. La malattia è sottodiagnosticata proprio a causa di segni clinici poco specifici e la circolazione silente del virus è ben documentata. I tassi di prevalenza negli ovini variano notevolmente, sia tra i vari paesi sia da regione a regione all'interno dei Paesi. In una determinata area geografica, la sieroprevalenza può variare dal 5% a oltre il 90% tra gli ovini adulti, a seconda della gestione dell'allevamento, mentre la mortalità dipende dal momento dell'infezione, dalla virulenza del ceppo infettante, dal sistema di gestione dell’allevamento, della presenza di soggetti  persistentemente infetti, da eventuali contratti tra allevamenti diversi.

Sebbene sia praticamente impossibile monitorare i cambiamenti temporali nella presenza di genotipi nei vari paesi, la classificazione antigenica e genetica degli isolati provenienti da diverse regioni geografiche, nonché lo studio delle relazioni tra diversi Pestivirus, sono essenziali per migliorare le conoscenze sull'epidemiologia del BDV.

ORGANIZZAZIONE GENOMICA

Il BDV è un virus con envelope di forma sferica (40-60 nm) e il suo genoma è costituito da un RNA a singolo filamento, a polarità positiva. Il genoma di BDV, del peso di circa 12.300 nucleotidi, consiste di un’unica open reading frame (ORF) e di 2 untranslated regions (UTR), una al 5’ e una al 3’. L’ORF codifica per quattro proteine strutturali, il capside (C) e tre glicoproteine dell’envelope (Erns, E1 ed E2), e da sette a otto proteine non strutturali (Npro, p7, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B).

Ad oggi, la tipizzazione sistematica degli isolati di BDV, basata sulle regioni 5’-UTR, Npro ed E2, ha portato all'identificazione di otto genotipi (da BDV-1 a BDV-8). BDV-1, con i sottogruppi putativi BDV-1a e BDV-1b, e BDV-2, costituito esclusivamente da isolati tedeschi, sono stati originariamente denominati rispettivamente BDV-A e BDV-B. BDV-3 è il genotipo più diffuso in Europa, seguito da BDV-1, che è il genotipo diffuso in tutto il mondo. BDV-4, con i probabili sottogruppi BDV-4a e BDV-4b, originariamente indicato con il nome di BDV-C, è predominante in Spagna. BDV-5 e BDV-6 sono stati segnalati per la prima volta in Francia. Nel 2005, il primo membro di un nuovo gruppo di pestivirus è stato individuato in Italia: trattasi del nuovo genotipo BDV-7, che attualmente è stato rilevato solo in Italia. BDV-8 è stato successivamente segnalato da un capretto e da un camoscio in Italia, nonché da bovini, ovini e suini in Svizzera. Attualmente l'Italia è il paese in cui è stato documentato un notevole numero di genotipi di BDV, grazie ad una maggior attenzione alla sorveglianza molecolare, riscontrando una maggiore diversità genetica del virus rispetto ad altri paesi indagati.

In generale, le indagini molecolari rappresentano uno strumento utile per prevenire e controllare la diffusione della malattia e per identificare i cambiamenti delle caratteristiche genetiche degli isolati, monitorando i ceppi di pestivirus nei ruminanti, in particolare negli allevamenti misti. Gli studi di epidemiologia molecolare ed analisi filogenetica del BDV migliorano la comprensione della patogenesi e delle vie di infezione, stabiliscono relazioni genetiche tra i diversi isolati e valutano la loro distribuzione temporale nelle popolazioni animali. Infine, a causa della diffusione del BDV e delle criticità nel controllo della malattia, la determinazione della relazione antigenica tra gli isolati di pestivirus gioca un ruolo importante nella diagnosi e nella pianificazione di strategie di controllo dell’infezione.

VARIABILITA’ DELLA MALATTIA

La variabilità genetica tra gli stipiti virali di BD è maggiore rispetto a quella delle altre specie di Pestivirus. Non esistono sierotipi definiti, ma gli isolati del virus presentano una notevole diversità antigenica, in alcuni casi non chiara, che potrebbe rendere complicata la diagnosi e l’eventuale risposta immunitaria. A fronte degli otto diversi genotipi di BDV ad oggi identificati e diffusi in tutto il mondo, si può ipotizzare che la omologia di sequenze, osservata tra alcuni virus isolati da paesi non contermini, possa essere associata, almeno in parte, al commercio internazionale di animali. Poichè la relazione tra le differenze genetiche e antigeniche è in gran parte sconosciuta, i test diagnostici sia sierologici che molecolari potrebbero non rilevare tutti i ceppi circolanti con la stessa efficacia.

VIE DI TRASMISSIONE

Il virus diffonde attraverso il contatto diretto tra animali infetti e animali suscettibili, solitamente attraverso la via oronasale, ma anche per contatto indiretto, per esempio tramite vettori meccanici e insetti. Tuttavia la trasmissione verticale attraverso la placenta svolge un ruolo cruciale nell'epidemiologia della malattia. L'infezione dei feti può portare alla nascita di agnelli persistentemente infetti (PI) che sono viremici, negativi ai test di ricerca degli anticorpi, ed escretori del virus. I capi PI rappresentano, di fatto, i principali serbatoi del virus, in virtù dell'elevato titolo virale rilasciato nelle loro secrezioni. Fino ad oggi non è noto se le infezioni persistenti si verifichino anche negli ungulati selvatici, in analogia a quanto avviene nei domestici.

Ulteriori fonti del virus sono naturalmente feti abortiti, membrane fetali e fluidi utero cervicali, ma anche la fauna selvatica potrebbe svolgere un ruolo importante come serbatoio virale ed essere fonte di infezione, in seguito al contatto diretto con il bestiame infetto, la condivisione di aree di alimentazione e abbeveraggio o la presenza di individui infetti da pestivirus all'interno di un'azienda.

BDV può anche causare infezioni acute e persistenti, tuttavia la trasmissione del virus da parte di animali infettati acutamente non è altrettanto efficiente.

Negli ovini, l’infezione comporta perdite a livello di nuovi nati, incremento di aborti e nascita di animali non sani. Nelle capre, l’infezione da BDV non è comune e, in particolare, l'infezione persistente è rara, poiché l'aborto è il principale segno di presentazione della malattia. Anche i suini possono essere infettati da pestivirus diversi da quello della Peste suina classica e gli anticorpi contro il BDV nei suini possono interferire con i test per la diagnosi della PSC.

SEGNI CLINICI E LESIONI POST - MORTEM

Il periodo di incubazione riconosciuto per BDV varia da 2 a 14 giorni. La gravità della malattia dipende molto dalla virulenza del ceppo infettante e dallo stato immunitario dell’animale. In generale, i segni clinici principali sono l'infiammazione emorragica della mucosa e un generale deterioramento fisico ma alcuni isolati possono causare la sindrome emorragica. Negli animali adulti, la BD è spesso un’infezione subclinica.

L'infezione transplacentare può portare a placentite, morte fetale e aborto, mummificazione fetale, malformazioni fetali (soprattutto a carico del SNC), nati morti o deboli, e allo sviluppo di ungulati persistentemente viremici, a seconda dello stato di sviluppo del feto e del biotipo (citopatogeno o non citopatogeno) del virus. Infatti, come per BVDV, anche l’infezione da BDV nella fase iniziale della gestazione può portare alla nascita di animali PI, permanentemente sieronegativi o solo debolmente sieropositivi.

Infezione acuta: Gli ovini sani, sia neonati che adulti, esposti al BDV di solito presentano solo una malattia lieve o inapparente. Una leggera febbre e una lieve leucopenia sono associate a una viremia di breve durata rilevabile tra i giorni 4 e 11 dopo l'infezione, dopodiché nel siero compaiono anticorpi neutralizzanti il virus. È stato dimostrato che isolati occasionali di BDV producono febbre elevata, leucopenia profonda e prolungata, anoressia, congiuntivite, secrezione nasale, dispnea e diarrea e una mortalità del 50% nei giovani agnelli.

Infezione fetale: I principali segni clinici della BD si manifestano in seguito all'infezione di pecore gravide. Mentre l'infezione materna iniziale è subclinica o lieve, le conseguenze per il feto sono gravi. La morte fetale può verificarsi in qualsiasi fase della gravidanza, ma è più comune nei feti infettati all'inizio della gestazione. I piccoli feti morti possono essere riassorbiti o l'aborto può passare inosservato perché le pecore continuano a nutrirsi bene e non mostrano alcun segno di disagio. Con l'avvicinarsi del parto, si assisterà all'aborto di feti più grandi, a nati morti e alla nascita prematura di agnelli piccoli e deboli.

La conferma che un aborto o un parto morto sia dovuto al BDV è spesso difficile da stabilire, ma in alcuni casi il virus può essere isolato dai tessuti fetali. L'uso di un appropriato test biomolecolare ha il duplice vantaggio della elevata sensibilità e della capacità di rilevare il genoma virale. Nei feti abortiti è anche possibile rilevare il virus mediante immunoistochimica del cervello, della tiroide e di altri tessuti. I campioni di fluidi fetali o di siero devono essere analizzati per la ricerca di anticorpi BDV.

Le pecore PI apparentemente sane derivanti da un'infezione congenita possono essere identificate mediante la rilevazione diretta del virus o dell'acido nucleico nel sangue o nei tessuti o mediante l'isolamento del virus in coltura cellulare seguito da immunocolorazione per rilevare il virus non citopatogeno.

In un allevamento infetto si nota un numero eccessivo di pecore sterili, mentre gli agnelli vivi malati presentano le principali caratteristiche cliniche della BD. I segni clinici degli agnelli affetti da BD sono molto variabili e dipendono dalla razza delle pecore, dalla virulenza del virus e dal momento in cui l'infezione è stata introdotta nel gregge. Gli agnelli colpiti sono generalmente piccoli, deboli, incapaci di mantenere la stazione quadrupedale. Spesso sono evidenti segni nervosi e alterazioni del vello. I segni nervosi della BD sono il suo tratto più caratteristico. Il tremore può variare da violente contrazioni ritmiche dei muscoli delle zampe posteriori e del dorso, a tremori sottili appena percettibili della testa, delle orecchie e della coda. Le anomalie del vello sono più evidenti nelle razze a pelo liscio, che sviluppano velli pelosi, soprattutto sul collo e sulla schiena. Negli agnelli affetti da BD si può osservare anche un'anomala pigmentazione marrone o nera del vello.

I campioni di sangue da analizzare per la presenza di BDV o anticorpi devono essere raccolti in anticoagulante dagli agnelli sospetti prima che abbiano ricevuto il colostro. Una volta che gli agnelli hanno ingerito il colostro, è difficile isolare il virus finché non hanno 2 mesi e i livelli di anticorpi materni non sono diminuiti. Tuttavia, durante questo periodo, può essere possibile rilevare l'antigene virale in biopsie cutanee, mediante immunoistochimica per la ricerca dell’antigene virale, in leucociti lavati mediante test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) o mediante RT-PCR per l’identificazione del genoma del virus. I test ELISA diretti alla rilevazione dell'antigene Erns sembrano essere meno soggetti all'interferenza degli anticorpi materni e spesso possono essere utilizzati per rilevare l'antigene nel siero.

Nei casi di malattia, possono verificarsi decessi a qualsiasi età degli agnelli. I segni nervosi diminuiscono gradualmente e possono scomparire entro i 3-6 mesi di età. La debolezza e l'ondeggiamento dei quarti posteriori, insieme a un leggero tremolio della testa, possono ricomparire nei momenti di stress. Gli agnelli colpiti spesso crescono lentamente e, in condizioni normali, molti muoiono prima o intorno allo svezzamento. Nei casi in cui le perdite al momento dei parti sono state basse e non sono nati agnelli con segni evidenti di BD, questo può essere il primo segno di malattia. Alcune infezioni fetali che si verificano intorno alla metà della gestazione possono dare origine ad agnelli con gravi segni nervosi, disturbi locomotori e scheletri anormali. Tali agnelli presentano lesioni di ipoplasia e displasia cerebellare, idranencefalia e porencefalia derivanti da infiammazione necrotizzante. Le gravi lesioni distruttive sembrano essere immuno-mediate e gli agnelli con tali lesioni presentano spesso alti titoli di anticorpi contro il BDV. La maggior parte degli agnelli infettati in tarda gestazione sono normali e sani e nascono privi del virus ma con anticorpi contro il BDV. Alcuni di questi agnelli possono essere deboli e possono morire nelle prime fasi di vita.

Viremia persistente: Quando i feti sopravvivono a un'infezione che si verifica prima dell'inizio della competenza immunitaria, nascono con una viremia persistente. Il feto ovino può rispondere per la prima volta a uno stimolo antigenico tra circa 60 e 85 giorni del suo periodo di gestazione di 150 giorni. Nei feti infettati prima dell'inizio della competenza immunitaria, la replicazione virale è incontrollata ed è comune la morte fetale del 50%. Negli agnelli che sopravvivono all'infezione all'inizio della gestazione, il virus è diffuso in tutti gli organi. Questi agnelli sembrano essere tolleranti al virus e hanno un'infezione persistente, di solito per tutta la vita. Un campione di sangue pre-colostrale sarà positivo al virus e negativo agli anticorpi. In genere, non vi è alcuna reazione infiammatoria e le alterazioni patologiche più caratteristiche riguardano il sistema nervoso centrale (SNC) e la cute. In tutto il sistema nervoso centrale si verifica una carenza di mielina, che causa i segni nervosi. Nella pelle, i follicoli primari di lana aumentano di dimensioni e il numero di follicoli secondari di lana diminuisce, causando il vello peloso o ruvido. Per questi motivi, gli agnelli colpiti sono più piccoli della norma, con un mantello estremamente peloso e possono presentare tremori muscolari involontari, soprattutto del tronco e degli arti posteriori e, talvolta, difetti scheletrici, soprattutto a livello di pastorali e mandibola.

Gli ovini persistentemente viremici possono essere identificati attraverso la rilevazione di antigeni virali, acidi nucleici o virus infettivi in un campione di sangue. La viremia è facilmente rilevabile mediante analisi del siero in qualsiasi momento, tranne che nei primi 2 mesi di vita, quando il virus può essere mascherato dagli anticorpi colostrali e, eventualmente, negli animali di età superiore ai 4 anni, alcuni dei quali sviluppano bassi livelli di anticorpi anti-BDV. Per evitare l'interferenza degli anticorpi, si possono preferire metodi diversi dall'isolamento del virus. Quando si sospetta la presenza di anticorpi colostrali, il virus può essere individuato nei leucociti lavati e nella pelle utilizzando test ELISA sensibili. Sebbene la rilevazione del virus nel sangue durante un'infezione acuta sia difficile, la viremia persistente deve essere confermata ritestando gli animali dopo un intervallo di almeno 3 settimane. L'uso delle metodiche biomolecolari deve essere preso in considerazione in ogni momento e per qualsiasi tipo di campione, grazie alla elevata sensibilità analitica e alla mancanza di interferenze da parte degli anticorpi presenti nel campione.

Alcune pecore viremiche sopravvivono fino alla maturità sessuale e vengono utilizzate per la riproduzione. Gli agnelli nati da queste madri infette sono sempre persistentemente viremici. Le pecore persistentemente viremiche, che presentino o meno segni clinici, sono serbatoi a lungo termine e diffondono continuamente il virus in tutte le secrezioni ed escrezioni corporee. Poichè la loro identificazione è un fattore importante in qualsiasi programma di controllo, gli ovini che vengono commercializzati dovrebbero essere sottoposti a screening per verificare l'assenza di viremia da BDV.

Di solito gli arieti persistentemente infetti (PI) hanno una qualità riproduttiva scarsa, con sperma altamente infettivo e fertilità ridotta. Tutti gli arieti utilizzati per la riproduzione dovrebbero essere sottoposti a screening per l'infezione persistente da BDV su un campione di sangue. Anche i campioni di sperma possono essere sottoposti a screening per il virus, ma l'isolamento del virus è molto meno soddisfacente rispetto al sangue a causa della tossicità dello sperma per le colture cellulari. Le metodiche biomolecolari di solito superano i problemi di tossicità e quindi possono essere utile per analizzare lo sperma degli arieti.

Malattia ad insorgenza tardiva in pecore persistentemente viremiche: Alcune pecore PI possono sviluppare spontaneamente diarrea intrattabile, deperimento, eccessive secrezioni oculari e nasali, talvolta con distress respiratorio. Alla necroscopia, queste pecore presentano un ispessimento grossolano dell'ileo distale, del cieco e del colon, dovuto a un'enteropatia iperplastica focale. Il BDV citopatico può essere recuperato dall'intestino di questi agnelli. Non essendoci un'evidente fonte esterna di virus citopatico, è molto probabile che tale virus provenga dal pool di virus dell'agnello stesso, analogamente a quanto accade con la BVDV. Le altre pecore PI del gruppo non sviluppano la malattia. Questa sindrome, che è stata prodotta sperimentalmente e riconosciuta in occasionali focolai di BD sul campo, presenta diverse somiglianze con la malattia della mucosa bovina (MD) ed è inevitabilmente fatale.

Le lesioni post-mortem comprendono erosione e ulcerazione della mucosa orale, enterite emorragica e compromissione fisica generale. Sono stati descritti piressia, anoressia, salivazione e scolo nasale; alcuni animali con MD presentano lesioni cutanee e possono essere zoppi a causa dell'ulcerazione interdigitale e dell'infiammazione delle bande coronarie.